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單個核細(xì)胞的分離純化方法
點(diǎn)擊次數(shù):526 更新時間:2022-10-19

外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)主要指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞,是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)最/常用的細(xì)胞,也是進(jìn)行T細(xì)胞和B細(xì)胞分離純化的重要環(huán)節(jié)。

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1.原理

PBMC的密度與血液中的其他成分不同。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞的密度較大,為1.092左右;淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的密度為1.076~1.090;血小板為1.030~1.035。因此,利用一種密度介于1.076~1.090之間、近于等滲的溶液(分層液)進(jìn)行密度梯度離心,可使不同類別的血細(xì)胞按其相應(yīng)密度分布,從而被分離。

2.方法

1)聚蔗糖-泛影/葡胺分層液法 聚蔗糖-泛影/葡胺(Ficoll-hypaque,F(xiàn)-H)分層液為密度梯度離心法最/常用的分離液,其主要成分是聚蔗糖和泛影/葡胺。聚蔗糖 (Ficoll) 分子量為40kD,具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點(diǎn);常用的Ficoll溶液濃度為6%,密度為1.020。泛影/葡胺 (Hypaque) 用來增加密度,適量加入密度為1.200、濃度為34%的Hypaque于Ficoll溶液中,配成密度為1.077±0.001的分層液,稱為淋巴細(xì)胞分層液,用于淋巴細(xì)胞的分離。

分離細(xì)胞時,將肝素抗凝全血疊加在分層液上,使兩者形成一個清晰的界面。水平離心后,形成不同層次的液體和細(xì)胞區(qū)帶,從而分離出PBMC 。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液,同時因紅細(xì)胞遇Ficoll而凝集成串錢狀,沉積于分層液底部;血小板因密度小而懸浮于血漿中;PBMC的密度稍低于分層液,故位于血漿層和分層液的界面中,呈白膜狀。吸出單個核細(xì)胞,計(jì)數(shù),用臺盼藍(lán)染色檢查細(xì)胞活力。

本法分離單個核細(xì)胞的純度可達(dá)95%,細(xì)胞獲得率達(dá)80%以上,細(xì)胞活性達(dá)95%以上小鼠淋巴細(xì)胞的比重與人淋巴細(xì)胞比重不同,若分離小鼠淋巴細(xì)胞應(yīng)選用小鼠淋巴細(xì)胞分離液,比重1.092±0.001。

2)Percoll分層液法

Percoll是經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP) 處理的硅膠顆?;鞈乙海瑢?xì)胞無毒性和刺激性。Percoll混懸液的硅膠顆粒大小不一,經(jīng)過高速離心后,可形成一個連續(xù)密度梯度,將比重不同的細(xì)胞分離純化。

將1份10XPBS與9份Percoll貯存液混合,制成等滲Percoll懸液,此懸液被認(rèn)為是100%Percoll懸液,其密度為1.1294g/ml。用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋100%Percoll而獲得所需密度的Percoll分離液用于相應(yīng)細(xì)胞的分離。若分離淋巴細(xì)胞應(yīng)使用1.0777g/ml,配制時用稀釋液稀釋60%即可。

取比重1.077的Percoll分離液X ml與離心管中,將等倍稀釋的抗凝血1/2 X ml 小心疊加在分離液上,經(jīng)水平離心(1500rpm)后,便得四個細(xì)胞層,從而分離出淋巴細(xì)胞。表層為死細(xì)胞殘片和血小板,底層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞,中間有兩層,上層富含單核細(xì)胞,下層富含淋巴細(xì)胞。

該法是純化淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的一種較好的方法,淋巴細(xì)胞純度高達(dá)98%,單核細(xì)胞純度可達(dá)78%。 

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