長期以來，人們認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟的神經(jīng)元很難或不能在進行分裂和增殖，屬于終末分化細胞。因而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、變性導致的神經(jīng)元丟失及缺損難以修復，神經(jīng)功能的重建被視為幾乎不可能。神經(jīng)干細胞在體外分離培養(yǎng)和增殖的成功，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生和功能重建提供了新的可能途徑。
“養(yǎng)細胞難、養(yǎng)原代細胞更難、養(yǎng)原代神經(jīng)干細胞難上加難！”
今天，遠慕生物為大家詳細講解原代神經(jīng)干細胞取材及培養(yǎng)的那些事，手把手教你輕松搞定~
神經(jīng)干細胞
神經(jīng)干細胞是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力，能自我更新并能提供大量腦組織細胞的細胞群，具有自我更新能力和多向分化潛能，對損傷和疾病具有反應能力。原代培養(yǎng)的單細胞在24h內(nèi)自動聚集成團，這是神經(jīng)干細胞在體外培養(yǎng)過程中的一個重要特征。
原代取材及培養(yǎng)
步驟一.原代取材：
1.脫頸處死2周齡孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手術剪打開腹腔，取出子宮，剪開子宮，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培養(yǎng)皿中。
2.將胎鼠斷頭，用眼科剪分離顱骨及硬腦膜，取出腦組織，在顯微鏡下充分取出腦膜和血管組織。
3.將腦組織用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的組織塊，至于含DMEM/F12的離心管中，吸管輕吹打10次，靜置離心管1~2min，取細胞懸液。重復2-3次。
4.細胞懸液以700r/min離心6min,吸除上清，獲得細胞沉淀。用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重懸后，過200目篩網(wǎng)，并計數(shù)。
5.按5×105/ml密度接種，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)。2天后隔天換液。通常一周左右，神經(jīng)球長出。
步驟二.傳代培養(yǎng)：
1.在光鏡下觀察細胞球中心已出現(xiàn)灰黑色區(qū)域時進行傳代，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15ml離心中，800r/min離心5min，棄上清。
2.加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化2-3min，加入胰酶抑制劑終止消化，輕輕吹打神經(jīng)球至至細胞懸液， 800r/min離心5min，棄上清。
3.加入適量干細胞培養(yǎng)液Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF（添加谷氨酰胺），調(diào)整細胞濃度為5×105/ml，置于37℃，5%CO2繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
實驗影響因素1.供體年齡的影響
實驗研究顯示，胚胎鼠大腦皮質(zhì)中的神經(jīng)干數(shù)量明顯高于新生鼠，且胎齡為12~15d左右的鼠胚胎體內(nèi)的神經(jīng)干的分化能力qiang。
2.分離方法對細胞純度及活力的影響
常用的細胞分離方法有機械分離法和酶消化分離法。機械分離法的缺點是吹力度和次數(shù)不易掌控，且機械切割作用會使細胞活性降低；酶消化法缺點是消化的時間不易掌握，并且用于分離神經(jīng)干細胞的消化酶對細胞具有潛在的損害作用。
3.接種密度對神經(jīng)干的影響
神經(jīng)干細胞的適宜接種濃度一般可用1×10*8/L~1×10*9/L，接種細胞密度過小，細胞不成球，不利于細胞增殖；接種細胞密度過大，第一次傳代后很快出現(xiàn)死亡、特大、散亂、單細胞數(shù)迅速增多。采用半量換液的方法可以da程度地使細胞生存環(huán)境保持穩(wěn)定,有利于細胞生長。
4.傳代培養(yǎng)時機的影響
神經(jīng)干細胞經(jīng)過原代培養(yǎng)后中，細胞數(shù)量大量增殖，必將導致大部分神經(jīng)干細胞因缺乏營養(yǎng)而死亡，因此及時進行傳代是防止其死亡的關鍵，有文獻報道一般選用原代培養(yǎng)5~7 d時進行，既可避免細胞過度增殖而死亡, 又保持細胞增殖的活性。
注意事項
1.為維持取材過程中的細胞活性，在取材整個過程中應都在冰上進行并且在剝離腦膜和血管組織中要在含有10%FBS高糖培養(yǎng)基中，因為胎鼠神經(jīng)干代謝旺盛，長時間在無糖環(huán)境對神經(jīng)干造成損傷。
2.在取材過程中，不要取一個皮層，剝離一個腦膜血管，而是快速將所有胎鼠皮層取下來，放到高糖培養(yǎng)基中。
3.剝離腦膜及血管應全部分離干凈，否則在制作單細胞懸液時，會被迫加大吹打力量和次數(shù)，造成細胞損傷。
4.在培養(yǎng)過程中，為防止細胞貼壁分化，隔天輕輕晃動培養(yǎng)基。
5.避免細胞污染。加強無菌操作意識，做好實驗室、實驗器械等的消毒工作。
