也許你很難想象一片葉子、一塊肌肉、一管血液都經(jīng)歷了什么，后以核酸的形式呈現(xiàn)。核酸的提取是所有分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，核酸提取的質(zhì)量、濃度的多少對(duì)于下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗起著關(guān)鍵的作用，今天我們就說一說關(guān)于DNA提取的那些事兒。

一. DNA提取原則

1、保證DNA分子的完整性

2、排除有機(jī)溶劑與金屬離子的干擾

3、排除蛋白質(zhì)、多糖、多酚、脂類的污染

4、獲得高純度的核酸

5、方法操作簡便，穩(wěn)定性強(qiáng)

二. DNA有哪些

染色體DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、質(zhì)粒DNA、病毒/噬菌體DNA等。

三. 樣本的收集保存

注：詳細(xì)操作可參見《派森諾樣品制備及質(zhì)量要求》文件，可向當(dāng)?shù)劁N售或技術(shù)-支持索取。

四. DNA提取原理及方法

目前提取DNA的方法繁多，如CTAB法、SDS法、各種試劑盒等，但原理大致相同，主要是裂解和純化兩大步驟。首先對(duì)樣品破壁裂解，采用機(jī)械力、化學(xué)試劑、酶等方法將DNA釋放出來，隨后去除蛋白質(zhì)、糖、酚、金屬離子等雜質(zhì)，再用無水乙醇、異丙醇沉淀或載體吸附DNA，之后洗滌溶解即可得到核酸。

雖然原理相似，但不同提取方法使用的試劑有很大差別，下面列舉出在提取過程中，常用試劑的作用及原理：

1、裂解相關(guān)試劑

（1）CTAB（十六烷基*基-溴化銨）:一種陽離子表面活性劑，在高鹽溶液中，CTAB可與蛋白質(zhì)和中性多糖形成復(fù)合物而沉淀，但不能沉淀核酸和酸性多糖，另外它還能保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸酶的降解。

（2）SDS（十二烷基硫酸鈉）:一種陰離子去污劑，可使細(xì)胞膜崩解，與膜蛋白疏水部分結(jié)合并使其與膜分離，使蛋白變性。

（3）PVP(聚乙-烯吡-咯烷酮):是酚類化合物的螯合劑，可與多酚化合物形成復(fù)合體，使其不被氧化成醌類。

（4）β-巰基乙醇：抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。

（5）蛋白酶K：用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解，將蛋白質(zhì)降解成小分子肽或氨基酸，使DNA分子分離出來。

2.純化相關(guān)試劑耗材

（1）苯-酚：使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了DNase的降解作用。

（2）氯-仿：克服酚的缺點(diǎn)，加速有機(jī)相與液相分層，去除核酸溶液中的跡量酚（酚易溶于氯-仿中）。

（3）異-戊醇：少許異-戊醇可以減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡，有助于分相，保持體系的穩(wěn)定。

（4）無水乙醇：沉淀DNA，不易沉淀鹽類等物質(zhì)；異丙醇也可沉淀DNA，體積小時(shí)間短，但易沉淀鹽類物質(zhì)。

（5）核酸純化柱：采用硅膠膜作為核酸的特異性吸附材料（高鹽低pH值結(jié)合核酸），同時(shí)去除其他雜質(zhì)，可以-大程度地回收樣品中的DNA（低鹽高pH值洗脫），可以用于各物種的DNA提取。操作簡單、用時(shí)短、純度高。

（6）DNA提取磁珠：是一種核心為四氧化三鐵、表面修飾大量硅羥基的磁性微球，能在高鹽、低pH條件下和溶液中的核酸通過疏水作用、氫鍵作用和靜電作用等發(fā)生特異性結(jié)合，而不與其它雜質(zhì)（如蛋白）結(jié)合，可迅速從生物樣品中分離核酸，操作安全簡單，非常有利于核酸的自動(dòng)化和高通量提取。

五. 核酸的保存

短時(shí)間（24h內(nèi)）可放置4℃保存，長期（24h以上）放置于-20℃進(jìn)行保存，期間避免反復(fù)凍融。對(duì)于純度不高、總量較少、完整度不好的非高質(zhì)量核酸，還需盡早進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以防保存時(shí)間過長，DNA質(zhì)量更受影響，進(jìn)而影響建庫和測(cè)序質(zhì)量。

以上為大家列舉了在提取過程中經(jīng)常用到的試劑及原理，給出了核酸保存的建議。要強(qiáng)調(diào)的是相同的原理下，不是試劑的去污、裂解效果越好就用的越多，還是要在實(shí)際提取過程中，根據(jù)提取材料的不同、提取結(jié)果的差異，靈活調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案。