一、 細胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)置及設(shè)備

（一）細胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)置

組織細胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實驗室工作的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。目前，超凈工作臺的廣泛使用，很大程度上方便了組織細胞培養(yǎng)工作，并使一些常規(guī)實驗室有可能用于進行細胞培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)實驗室應能進行六方面的工作：無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲藏。

1．無菌操作區(qū)

（1）無菌操作室：無菌操作區(qū)只限于細胞培養(yǎng)及其他無菌操作的區(qū)域，*能與外界隔離，不能穿行或受其他干擾。

理想的無菌操作室應劃為三部分：

a) 更衣室—―供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口/罩。

b) 緩沖間—―位于更衣間與操作間之間，目的是為了保證操作間的無菌環(huán)境，同時可放置恒溫培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器。

c) 無菌操作間—―專/用于無菌操作、細胞培養(yǎng)。其大小要適當，且其頂部不宜過高（不超過2.5m）以保證紫外線的有效滅菌效果；墻壁光滑*以便清潔和消毒。工作臺安置不應靠墻壁，臺面要光滑壓塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。

無菌操作間的空氣消毒：

紫外線燈—－產(chǎn)生臭氧，并且室內(nèi)溫度及濕度均較高，不利于工作人員健康。

空氣過濾的恒溫恒濕裝置—－*。

表1 潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度級別表

潔凈度級別 塵粒蕞大允許數(shù)／立方米 微生物蕞大允許數(shù) 浮游菌／立方米 沉降菌／皿

100級 3,500 0 5 1

10000級 350,000 2,000 100 3

100000級 3,500,000 20,000 500 10

300000級 10,350,000 60,000 - 15

無臭氧紫外線消毒器

電子消毒滅菌器—－在高壓電場作用下，電子管的內(nèi)外電極發(fā)生強烈電子轟擊，使空氣電離而將空氣中的氧轉(zhuǎn)換成臭氧。臭氧是一種強氧化劑，能同細菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進行氧化分解反應，從而靠臭氧氣體彌漫性擴散達到殺菌之目的，消毒時沒有死角。消毒后空間的殘留臭氧只需30～40min即能自行還原成氧氣，空氣不留異味，消毒物體表面不留殘毒。

（2）凈化工作臺：操作簡單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細菌培養(yǎng)室使用的凈化工作臺主要有兩種：a)側(cè)流式或稱垂直式 b)外流式或稱水平層流式。

凈化工作臺工作原理（大致相同）—－通常是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾，由離心風機壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的均勻的斷面風速通過無菌區(qū)，從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。

側(cè)流式工作臺—－空氣凈化后的氣流由左或右側(cè)通過工作臺面流向?qū)?cè)，也有從上向下或從下向上流向?qū)?cè)，形成氣流屏障保持工作區(qū)無菌。工作臺結(jié)構(gòu)為封閉式。

外流式（水平式）工作臺—－凈化后的空氣面向操作者流動，因而外方氣流不致混入操作，但進行有害物質(zhì)實驗操作則對操作者不利。工作臺結(jié)構(gòu)為開放式（已少用）。

凈化工作臺應用注意：

（1）凈化工作臺應安裝在隔離好的無菌間或清潔無塵的房間內(nèi)，以免塵土過多易使過濾器阻塞，降低凈化效果，縮短其使用壽命。

（2）新安裝的或長期未使用的工作臺，工作前必須對工作臺和周圍環(huán)境用真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的工具進行清潔工作，然后再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌進行滅菌處理。

（3）使用凈化工作臺前，應先用75％酒精擦洗臺面，并提前以紫外線滅菌燈照射30～50min處理凈化工作區(qū)內(nèi)積存的微生物。關(guān)閉滅菌燈后應啟動風機使之運轉(zhuǎn)兩分鐘后再進行培養(yǎng)操作。

（4）凈化工作區(qū)內(nèi)不應存放不必要的物品，以保持潔凈氣流流型不受干擾。

（5）注意凈化區(qū)內(nèi)氣流的變化，一旦感到氣流變?nèi)?，如酒精燈火焰不動，加大電機電壓仍未見情況改變則說明濾器已被阻塞，應及時更換。一般情況下，高效過濾器三年更換一次。更換高過濾器應請專-業(yè)人員操作，以保持密封良好。粗過濾器中的過濾布（無-紡布）應定期清洗更換，時間應根據(jù)工作環(huán)境潔凈程度而定，通常間隔3-6個月進行一次。

（6）凈化工作臺使用完畢應及時清理工作臺面上的物品并用酒精擦洗臺面使之始終保持潔凈。

（7）凈化工作臺應定期進行功能測試，檢查凈化工作臺各項工作指標是否達到要求，例如進行無菌試驗，定期檢查臺面空氣的潔凈度是否達標。

超凈工作臺的無菌程度檢查超凈工作臺在消毒處理后，無菌試驗前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)；取直徑約90mm平皿，在超凈工作臺內(nèi)點燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將平皿半開注入溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml，制成平板，在30～35℃預培養(yǎng)48小時，證明無菌后將平板3個，以無菌方式帶入超凈工作臺內(nèi)左、中、右各放一個；打開平皿蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將平皿蓋蓋好，置30～35℃培養(yǎng)48小時，取出檢查，100級清潔度要求：3個平皿上生長的菌落數(shù)平均不得超過1個。

超凈工作臺應定期請有關(guān)部門檢查其潔凈度，應達到100級（一般用塵埃粒子計數(shù)儀）檢測塵埃粒徑≤5祄的粒數(shù)不得超過3.5個／升；空氣流量應控制在0.75~1.0m3/s；細菌菌落數(shù)平均<1個，可根據(jù)無菌狀況必要時置換過濾器。

2．孵育區(qū)

本區(qū)對無菌的要求雖不比無菌區(qū)嚴格，但仍需清潔無塵，因此也應設(shè)置在干擾少而非來往穿行的區(qū)域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進行，后者費用高，一般實驗室多采用孵箱進行工作。

3．制備區(qū)

在該區(qū)主要進行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。

4．儲藏區(qū)

主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等，此環(huán)境也需要清潔無塵。

5．清洗和消毒滅菌區(qū)

清潔和消毒滅菌區(qū)應與其他區(qū)域分開，主要進行所有細胞培養(yǎng)器皿的清洗、準備、消毒及三蒸水制備等工作。